聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学领域功能最强大的技术之一，实时荧光定量PCR是在标准PCR技术基础上演变而来，常用于定量、定性分析样本中的DNA。1993年，这一技术性革命掀开了生物学的新篇章，不仅解决了传统PCR不能准确定量易造成污染出现假阳性的弊端，还具有灵敏度高，特异性、可靠性更好，自动化程度高，因此荧光定量PCR逐渐取代传统PCR。

举个例子，过去三年，新型冠状病毒在全球肆虐的时候，核酸检测是新冠病毒检测公认的“金标准”，而核酸检测依靠的即是荧光PCR扩增技术。在浩宇医学检验实验室，这一技术通常作为HPV分型检测、叶酸代谢基因检测、性病3项DNA检测等的常见检验手段，让用户在家就能享受更便捷、更准确的体检服务。

实时荧光PCR技术的发光原理

那么，实时荧光定量PCR这项“神奇”的生物技术是如何突破生物检测的重重“挑战”，最后把精确的实验结果呈现在人们眼前呢？这不得不提到荧光共振能量转移的原理（FRET）。

FRET原理，即在DNA扩增反应中加入荧光基团，当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团距离临近一定范围时，就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但两者一旦分开，淬灭作用即消失。研究人员利用荧光信号的变化实时检测每一个循环扩增产物量的变化，来进行定量分析。

考虑到实验目的、通量及成本因素等不同，采取的荧光实验方法也不尽相同。对于低通量、单重实验，一般优先考虑使用DNA结合染料SYBR Green I；而对于高通量实验，荧光染料标记引物或探针更为适合，荧光染料包括TaqMan 探针、MGB探针、双杂交探针等。（由于篇幅有限，本文只举例DNA结合染料SYBR Green I和TaqMan 探针2种实验方法。）

1、DNA结合染料SYBR Green I

SYBR Green I是一种普遍使用的DNA结合染料，它可以嵌合进DNA双链，但不结合单链。当SYBR Green I在溶液面未结合双链DNA时，仅产生很少的荧光，当它结合双链DNA时，就发射出1000倍以上的荧光信号，因此，一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsDNA量成比例，并且会随着扩增产物的增加而增加。

使用SYBR Green I的实验设计简单、省时，仅需要一对引物，能迅速检验多个基因，适合样本数较多的实验，而且初始成本更低，更多为研究人员所使用。但由于缺乏特异性，它可以结合任何的dsDNA，无法区分引物二聚体或非特异性扩增物，因此不适合用于多重定量分析。

2、TaqMan探针

TaqMan探针是在前一种方法的基础上，即除了一对引物还同时加入一个特异性荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭基团。开始时探针完整地结合在DNA单链上，此时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号。

PCR扩增时，Taq酶将探针酶切降解，使得报告荧光基团基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光信号。切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。因此，通过检测PCR反应体系中的荧光强度可以达到监测PCR产物扩增量的目的。

该方法引物和探针的结合特异性更高，数据更可靠，数据分析较简便，在目前国内的临床诊断中应用最为广泛。同时，该方法可使用不同的染料标记探针，在同一反应管中扩增检测不同的序列，相比于染料法的缺点即是需要根据不同的序列，设计合成不同的探针。

除此之外，跟根据不同的使用情况还发展出MGB探针、双杂交探针、分子信标、蝎型探针等类型的实时荧光定量PCR方法。

实时荧光定量PCR操作步骤

1、以DNA结合染料SYBR Green I的实验为例，需要的反应成分有含SYBR Green I的PCR反应液、模板、引物。反应液建议使用商家的预混液，模板则可以通过直接法或离心柱法得到高质量的mRNA，然后将mRNA逆转录为cDNA模板获得。

2、准备好后，要确定最佳的退火温度，一般使用低于引物的Tm 5℃作为最适退火温度，在具备温度梯度的PCR仪上就能确定。其次，构建标准曲线以确定反应性能。另外，由于SYBR Green I与所有dsDNA结合，所以需要通过分析扩增产物来检查qPCR的特异性。这可以通过荧光定量PCR仪上的熔点曲线功能来完成，也可以用凝胶电泳分析扩增产物。

3、在RNA-free的PCR管中加完模板，引物以及PCR反应液之后，使用两步法或三步法进行上机操作。值得注意的是，如果反应液中本就含有优化过的ROX，那么在操作时无需添加。ROX是一种被动染料，其荧光值水平在DNA扩增过程中保持稳定，从而能提高数据精确度。

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参考资料：

［1］《一文读懂｜实时荧光PCR技术》.医学界.2023.09.27

［2］《汇总 | 实时荧光定量pcr优势、原理和临床应用》.体外诊断IVD知识库.2022.01.15

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